基因敲除小鼠基因敲入小鼠模型建立价格优惠 年度促销-商家活动-资讯-生物在线

基因敲除小鼠基因敲入小鼠模型建立价格优惠 年度促销

作者:北京医科利昊生物科技有限公司 2012-11-15T08:45 (访问量:7882)

 

基因敲除小鼠利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为(1) 构建基因打靶载体; (2) 将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法导入同源的胚胎干细胞中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA 序列整合到内源基因组中从而得以表达; (3) 筛选发生同源重组的阳性克隆,通过显微注射或者胚胎凝集的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体

胚胎内制作嵌合体小鼠,在生物活体中研究特定基因的功能。基因敲除小鼠使得研究者们能够观察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改变,从而推断出特定基因的作用。

基因敲除小鼠基因打靶的原则是, 外源DNA 片段含有与目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列, 同源重组就发生在这两个序列之间。基因敲除小鼠外源DNA 序列的定位整合有两种方式, 即插入型(又称O 型) 和置换型(又称8 型)。与此相对应, 打靶载体可分为两类: 插入型载体和置换型载体。
基因敲除小鼠第一步,胚泡时期发育胚胎的分离。此胚胎来源于灰色品系的小鼠。


基因敲除小鼠第二步,从灰色小鼠胚泡中分离胚胎干细胞,在体外进行培养。
 

基因敲除小鼠第三步,用同源重组载体转染胚胎干细胞,用G418筛选发生了同源重组的细胞。

基因敲除小鼠第四步,将筛选得到的胚胎干细胞植入白色小鼠的早期胚胎(胚泡时期)中。

基因敲除小鼠第五步,将上述胚胎植入假孕母鼠(白色)子宫中。

基因敲除小鼠第六步,在母鼠所产的小鼠中,有一些是正常的白色,另一些则是嵌合体灰白相间的小鼠。这些嵌合体小鼠的细胞一部分起源于白色皮毛的胚泡细胞,另一部分则起源于重组的胚胎干细胞。起源于重组胚胎干细胞的皮毛显示出灰色斑块,很好辨认。

基因敲除小鼠第七步,嵌合体小鼠与野生型白色小鼠进行杂交,如果嵌合体小鼠的生殖细胞恰好是起源于重组胚胎干细胞,那么其子代小鼠就都应该呈现灰色。而这些灰色小鼠的所有细胞都是杂合体。
基因敲除小鼠第八步,杂合体灰色小鼠(+/H)之间进行杂交,得到灰色和白色的子代。从灰色子代中筛选出纯合小鼠(H/H),其一对同源染色体上的等位基因都失活,此纯合小鼠即为 “基因敲除小鼠构建”。
我们有开发的基因敲除小鼠构建APOE(动脉硬化研究),

基因敲除小鼠PEPT(白内障研究)

Shh+/- 基因敲除小鼠构建等小鼠: Shh(Sonic hedgehog)基因在脊椎动物胚胎组织形成中起着重要的作用,包括大脑、脊椎、中轴骨骼和四肢的形成。基因缺失的胚胎早期可以观察到中间结构如脊索和地板的形成和维持的影响,晚期可以观察到远肢结构的缺失以及独眼,腹部细胞包括神经管的缺失、脊柱和许多肋骨的缺失。基因敲除小鼠Shh蛋白被证实是脊椎动物发育过程中组织形成所必须的胞外信号。

 
 

外源和内源性双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在细胞内诱导同源序列基因表达受抑制的现象称为RNA 干扰(RNA interfering, RNAi)。RNAi (RNAinterference, RNA干扰)技术是将与内源 mRNA 编码区同源的小片段(19 -23bp)外源双链 RNA(double s`tranded RNA )导入细胞中,通过一系列细胞内反应引发细胞中相应 mRNA 的降解,从而导致特定基因表达沉默的一种技术。研究人员采用小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)来抑制特定的哺乳动物细胞基因的表达。RNAi 技术不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且在基因功能测定,基因治疗等方面开辟一条新思路。目前,RNAi 技术已应用于包括功能基因组学、药物靶筛选和细胞信号基因表达等研究中,并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。该技术成为了一种标准化的技术工具,可由专业熟练的技术服务商提供成套服务,将研究者从繁琐的具体实验操作中解脱出来,将更多的精力集中到开拓科研思路和设计实验方案上,更高效地做出高水平的研究成果。
基因沉默(RNAi/RNA干扰)小鼠构建
与化学合成siRNA相比,siRNA 质粒载体有以下优点:
1. siRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达。
2. 更加稳定、易控制。
3. 可用于稳定的细胞系建立。
4. 可用于诱变系统的建立。
5. 可建立基因敲除小鼠模型。
6. 含有GFP的载体可以用于监测转染效率。
7. 成本低廉。
缺点是:siRNA质粒载体的构建有一点难度,而且需要花费一定的时间。
我们提供的以慢病毒载体为基础的Lentiviral RNAi System能够高效稳定地沉默靶基因,为您提供了有效的基因功能研究手段。您提供待干扰基因的详细信息(基因的 mRNA 序列,Genbank序号和所属物种)后,我们为您设计3条以上针对目的mRNA的siRNA 靶序列,构建3个可用于目的mRNA干扰实验的siRNA 载体。基因沉默(RNAi/RNA干扰)小鼠构建
siRNA载体构建流程:
1. siRNA表达载体的选用
本公司选用的siRNA 表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记,可以建立稳定表达系,同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp抗性基因,可以无限扩增。
2. 设计siRNA靶序列
A 、根据目的mRNA序列,设计3条RNA干扰靶序列,靶序列一般为19 - 21nt 长,亦可由客户选择靶位点数量。
B 、对于每条选定的siRNA 靶序列,设计 siRNA 正义链和反义链,以 loop(9nt) 相连,称为 shRNA(short hairpin RNA)。
C、阴性对照的设立. 本公司提供多种用途的阴性对照,其正义链序列长12mer,GC含量为48%,且与NCBI RefSeq数据库中人、小鼠和大鼠的mRNA无同源性。
3. 合成模板
合成每条编码 shRNA的DNA 模板的两条单链,退火 DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。模板链后面连接RNA PolyIII聚合酶转录中止位点,两端分别设计酶切位点,克隆到 siRNA 载体多克隆位点的相同酶切位点之间。
4. siRNA 空载体经酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳,回收线性载体。
5. 连接与转化
把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶,插入片断与载体的摩尔比约为 3:1 。连接产物转化DH5α大肠杆菌,在LB Amp培养基,37 ℃培养过夜。
6. PCR 鉴定
7. 测序鉴定
8.柱抽提阳性克隆载体并定量。
RNAi整体实验服务内容和周期:

阶段
实验内容
基准周期
备注
siRNA/shRNA序列设计
每条靶基因选取3个靶点位置分别设计siRNA序列
1周
 
siRNA载体构建
将设计好的siRNA序列构建到具有合适筛选标记的质粒载体上
2周
免费提供带neo和GFP标记的载体,也可由您提供指定载体
细胞转染与筛选
采用脂质体转染的方法将构建的siRNA载体转染目标细胞并筛选阳性细胞
2周
 
基因沉默效果鉴定
采用RT-PCR和Western Blot方法检测靶基因的抑制效果
3周
由您指定检测方法和指标以及一抗的提供方式
基因沉默后细胞生理指标变化检测
采用各种方法检测靶基因抑制后细胞生理状况、功能水平等变化
4周
由您指定检测方法和指标
基因沉默稳定细胞株建立
传代培养获取稳定转染的细胞株
12周
 

基因沉默小鼠构建
显微注射法
12周
提供3个以上founder小鼠

 
以上实验项目您可以整体选择或分步选择,为您提供最大的灵活自主性。 选择整体服务以及老客户再次服务或推荐的,将尽力给予让您满意的优惠。基因沉默(RNAi/RNA干扰)小鼠构建
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