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彗星法DNA损伤测试盒说明书

作者:上海雅吉生物科技有限公司 2020-10-24T00:00 (访问量:1366)

 彗星法DNA损伤测试盒说明书

                                               彗星法

 

一、测定原理:

DNA 在自由基(如·OH)的攻击下容易发生损伤,即脱氧戊糖遭到破环,磷酸二脂键的断裂,碱基的破环或脱落,便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中,取少量细胞涂在载玻片上,用碱高盐溶液破坏细胞膜,再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将载玻片置于电泳液中,在电场的作用下,DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重, 碎片多,则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔,滞留在原处。用 PI 染色或银染,可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象,作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。

 

二、试剂盒组份:

组份

20T

储存条件

Lysis Bufffer

100ml

4℃保存

DMSO

8ml

4℃保存

正常熔点琼脂糖 NMA

30mg

4℃保存

低熔点琼脂糖 LMA

30mg

4℃保存

Propidium Iodide PI

400μl

4℃避光保存

 

 

 

 

 

 

 彗星法DNA损伤测试盒说明书

 

 

三、所需仪器及自备试剂:

 

低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和 45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube0.4mmol/L Tris-HClpH7.5)缓冲液、PBS

 

四、注意事项:Propidium IodidePI)和EB有毒,操作时要戴手套。

 

五、操作步骤:

 

1、细胞用冰冷的 PBS 洗一次,离心收集,用 PBS 重悬使其密度为 1×10^6 /ml

2、铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制,

 

1 层凝胶的制备:将载玻片的磨砂面向上,45℃预热,将预热 45℃的 100μl 0.5%正常熔点琼脂糖(NMA)铺于载玻片上,盖上干净的盖玻片,再置 4℃ 下 10min 使 NMA 凝固。

 

2 层凝胶的制备: 10μl 细胞(约 104 个)和 75μl 0.7%低溶点琼脂糖 LMA(在 37℃ 下水浴加热至少 20min 使之完全溶化)混合均匀。然后,轻轻揭去盖玻片,迅速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置 410min 使第 2 LMA 凝固。

 

 

3 层凝胶的制备: 2 LMA 凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热 37℃的75μl 0.7%低溶点琼脂糖 LMA,如上盖上盖玻片 4℃下凝固(第三层覆盖第二层周围 0.5mm,增加凝胶化作用时间至 30min,高湿度环境)。

 

3、细胞裂解:移去盖玻片,将玻片置于平皿中,倒入预冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9ml 加入 1ml DMSO),4℃裂解 12h,取出载玻片用 PBS 漂洗。

 

4、DNA 碱解旋:将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液(用户自备 1mmol/L EDTA300mmol/L NaOH),约覆过载玻片胶面 0.25cm 左右,室温放置 2060min,以便使 DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使 DNA 断链在电场中易于迁移。

 

5、单细胞电泳:在电压 25V,电泳 2030min,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。

 

6、中和与染色:电泳后将载玻片置于平皿内。加入 0.4mmol/L Tris-HClph7.5)缓冲液,将载玻片没入,4℃中和三次,每次 10min,弃去 Tris-HCl 缓冲液,每载玻片加 20μl PI 染液或 EB 染液,盖上盖玻片,避光染色 10min

 

7、观察、拍照和分析:荧光显微镜 515560nm 波长的激发光、PI 染色的 DNA 图象呈红色,EB 染色的DNA 图象呈桔红色,可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。每个样本随机选择100 个细胞,测定核DNA 直径和DNA迁移的长度,可并用相应的软件分析。

 

DNA 损伤按慧星尾部 DNA 量占全部 DNA 量的比例分为 5 级:

 

0 级:     5%           无损伤;

 

1 级:   5 20%          轻度损伤;

 

2 级:   2040%          中度损伤;

 

3 级:   4095%          高度损伤;

 

4 级:    95%          重度损伤。

  彗星法DNA损伤测试盒说明书

 

 

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