小鼠肿瘤模型的建立为肿瘤的生物学研究以及药物的开发提供了重要的实验平台。当前肿瘤模型多集中于裸鼠成瘤，即基于先天性胸腺缺陷的突变小鼠注射外源肿瘤细胞建立模型，而基于小鼠自身衍生的原位瘤模型较少。小编从CELL找了一篇集成AAV及Cas9技术建立的小鼠原位肺腺癌模型，有望推动更多原位瘤的建立，看看大牛是怎么做的吧！！！
Cas9模型鼠建立
作者将 Cas9 转基因表达盒插入 Rosa26 基因座来生成依赖于 Cre 的 Cas9 小鼠。转基因由 3× FLAG 标记的化脓性链球菌Cas9 组成，该 Cas9 通过自切割 P2A 肽与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 连接，以促进表达 Cas9 的细胞的可视化。转基因由普遍存在的 CAG 启动子驱动，并被 loxP-stop（3x polyA 信号）-loxP (LSL) 盒中断，从而使 Cre 重组酶可诱导 Cas9 表达。
为了评估延长 Cas9 表达的影响，通过将 Cre 依赖性 Cas9 小鼠与 β-肌动蛋白 Cre 驱动器杂交来生成组成型 Cas9 表达小鼠系,在整个身体中观察到 Cas9-P2A-EGFP 表达。组成型表达 Cas9 的小鼠可生育，产仔数正常，无形态异常，并且能够繁殖至纯合子。在细胞水平上，还没有发现 DNA 损伤和凋亡标志物的形态异常或上调，表明Cas9蛋白的表达不会引发细胞功能学的变化。
多基因癌症突变的体内建模
Cas9 介导的基因组编辑的多重性使多基因疾病过程（例如肿瘤发生）的建模成为可能。癌细胞的基因组具有复杂的遗传损伤组合，这通常包括原癌基因的功能获得性突变以及抑癌基因的功能丧失性突变。作者选择对涉及癌基因Kras和抑癌基因p53和Lkb1的肺腺癌突变进行建模，它们是人类肺腺癌中最常见的三个突变基因（p53为 46%，KRAS 为33%，LKB1为17% )，患者肿瘤中的p53和LKB1突变在本质上通常是功能丧失，因此直接设计单靶点将其敲除；但KRAS中的突变通常是导致功能获得的错义突变，为了模拟错义功能获得Kras突变，作者设计了一个 HDR 供体模板，将第 12 个氨基酸位置的甘氨酸 (G) 到天冬氨酸 (D) 突变，导致致癌KrasG12D突变。上述元件与包含 Cre 重组酶和海肾荧光素酶的表达盒组成AAV-KPL，并以气管内注射病毒的方式导入小鼠体内：
4 周后，从AAV9-KPL转导的小鼠和AAV9-sgLacZ转导的对照中收获肺，并通过 Illumina 测序进行表征。在预测的切割位点发现了p53和Lkb1中的插入缺失，占 0.1%整个肺中的p53插入缺失和0.4% Lkb1插入缺失，0.1% KrasG12D HDR。
注射后两个月，所有（5 个中的5个=100%）AAV9-KPL治疗的动物在肺中出现结节，而对照没有，两个月的平均总肿瘤负荷为~33 mm3，接近肺总体积的10%。
转导后 9 周注射 AAV9-KPL 或 AAV9-sgLacZ 的 Cre 依赖性 Cas9 小鼠的代表性立体显微镜肺图像，显示EGFP阳性肿瘤仅在注射 AAV9-KPL 的小鼠的肺内。解剖整个肺和单个肿瘤的Kras、p53和Lkb1突变分析，显示p53和Lkb1突变在快速生长的肿瘤中占主导地位，KrasG12D突变频率在整个组织中随时间增加（全叶水平由0.5%增加至1.8%），但在大肿瘤中不富集。这些数据表明，最大和生长最快的解剖肿瘤不依赖致癌Kras的生长，要么是因为p53，Lkb1双突变肿瘤在竞争中胜过含有KrasG12D的肿瘤，要么是因为在该模型中通过 HDR激活KrasG12D具有更长的潜伏期。
为了了解通过注射 AAV9-KPL 形成的肿瘤的病理学，作者进行了苏木精和伊红 (H&E) 染色和免疫组织化学 (IHC)。病理学显示，在注射后 1 个月出现多个 I 级和 II 级支气管肺泡腺瘤，在 2 个月内发展为 III 级肺腺癌，偶尔会发展为侵袭性 IV 级腺癌。大多数肿瘤 (178/182 = 95.7%) 前表面活性剂 C (pSPC) 染色阳性，pSPC 是 II 型肺细胞的标志物，暗示这些肿瘤中的多数起源于这种细胞类型。且Ki67(活跃的细胞周期蛋白)及CD31（血管内皮细胞标志物）染色阳性，表明肿瘤细胞增殖速度快且伴随血管生成。
小编心得
本文提供了较优的利用病毒介导小鼠原位成瘤的方法，与传统物理或者化学方法相比，病毒法操作简单，无其他毒副作用。虽然本文介绍的是肺原位成瘤，但不同肿瘤的发生往往伴随类似的基因突变，如抑制癌基因（P53,LKB1）的失活，按照本文的论述，最终推动肿瘤快速生长的依靠两个基因失活就足够了，当然，不同肿瘤可以考虑纳入其他基因的修正或失活。虽然本文依靠建立内源性的Cas9鼠搭配单个AAV，考虑到很多老师无法快速获得此种小鼠，可以考虑采取双病毒，一种表达Cas9，一种表达sgRNA，达到修正基因的目的。吉凯基因提供广泛的基因操作工具，满足不同课题的设计需要，对AAV感兴趣的老师，快来咨询吧！！!
【参考文献】
1.CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling