微量热泳(MST)是一种分析生物分子的技术。微尺度热泳是粒子在微观的温度梯度中的定向运动。生物分子结构/构象的变化引起的水化层的变化导致的沿温度梯度运动的相对变化可以用来确定亲和力。甚至像蛋白质磷酸化或小分子结合到靶标上都可以被监测。MST 也允许直接在溶液中测量分子间相互作用,而不需要一个固定的表面(无需固定)。微尺度热泳(MST)是一种新的方法,可以定量分析溶液中微升的分子间的相互作用。MST是基于热泳效应,即沿温度梯度定向的分子运动。一个空间的温度差ΔT导致分子浓度在温度升高的地区的变化, 用Soret系数ST定义为:C热/ C冷= EXP(-STΔT)。
MST是由总部设在慕尼黑的德国高科技公司NanoTemper技术有限公司发展出来的。
德国NanoTemper独特的MST技术,可应用于:
l直接在生物溶液环境中测量任何(生物)分子间亲和力(KD, 解离常数)
l研究血清、细胞裂解液或其它生物溶液对生物分子的作用,并且能够分离出真正的结合过
l直接在细胞膜上研究膜结合蛋白
l研究溶液中酶活性、复合物形成、定向组装过程的多组分反应或者生化成分
l使用荧光标记竞争物以无标记的方式获得更大的筛选项目(“竞争性MST”)
l一个靶标上不同结合位点的区分
l研究酶动力学(vmax, kcat)
l研究化学计量学并确定生物分子结合位点的数目
l研究结合能量学ΔG (自由能), ΔH (焓) and ΔS (熵)
l直接测量或是在竞争性实验中研究抑制物亲和力Ki
实验流程:
MST的实验方法,避免了昂贵的样品消耗和繁琐的制备过程。相对于其他的已有的测量分子间相互作用的技术,MST结合毛细管使用大大降低所需的实验成本,并且可以测量天然状态环境中的生物分子间的相互作用。
荧光分子的浓度的保持不变而结合分子的浓度梯度增加。一个4ul的样品量被填充在MST毛细血管,然后使用制造一个局部温度梯度。由于标记分子在玻璃毛细管中的运动导致的区域荧光强度变化就会被观测到。既可用标签/萤光蛋白来发光(NT.115系统),也可以用色氨酸自发荧光来检测(NT.LabelFree系统)。
荧光分子或颗粒最初是自由均匀分布的。在红外激光照射下,分子收到热泳动的作用力,而移出加热区域,最后分子在热泳动作用力和质量扩散作用力下达到平衡,形成稳定态。在关闭激光后,分子扩散重建均匀分布状态。下图显示了该过程。